IS-OGP：提升傳統(tǒng)顯微鏡在光遺傳學中的應用

光遺傳學是一種利用光來控制活體組織內細胞活動的技術。這可以是從廣泛照射腦組織以刺激實驗室動物的特定活動，到監(jiān)測單個神經元水平的通路。光遺傳學的一個關鍵要求是能夠精確地將光定向到實驗對象，主要是在顯微鏡下進行。

許多生物過程是基于離子濃度梯度在兩個親水區(qū)域之間，通過脂質膜的差異來進行的。例如，線粒體中的能量是以質子（pH）梯度的形式產生的，肌肉細胞的收縮是由鈉（Na+）和鈣（Ca2+）離子梯度介導的，而神經脈沖的傳遞涉及鈉（Na+）和鉀（K+）離子的流動。

幾十年來，研究人員在所謂的“膜片鉗"研究中使用微小機電探針研究和操縱這些電位；通常，微管電極插入細胞或對外膜形成密封。而現在，光遺傳學領域為這個謎題的另一面帶來了光子解決方案，即操縱這些細胞間的電位差。

第一個光遺傳學實驗利用了天然存在的、光激活的蛋白質，稱為視蛋白，用于充當特定離子的泵。一旦實驗原理被成功證明，研究會很快擴展到一系列的通道視紫紅質和其他類別的基因編碼工具（例如，C1V1）。這些光遺傳激活劑為科學家提供了一種機制，可以在毫秒內使用適當波長和強度的光來打開或關閉目標細胞（例如，肌肉細胞、大腦皮層神經元）。

光遺傳學在生命科學研究中具有極其廣泛的應用，從觀察孤立細胞的活動，到刺激實驗室動物的特定行為，再到研究大腦皮層中的神經通路。對于宏觀應用，照明需求通常相對簡單。在尺寸譜系的另一端，多光子激發(fā)顯微鏡使得在體內以單個神經元分辨率進行三維研究成為可能。在這些JI*端情況之間，許多實驗可以在常規(guī)光學顯微鏡下最*效地進行，只要有一種方法可以準確地將一個或多個輔助光源（激光、LED或過濾燈）對準視野中的一個或多個目標。為了支持此類工作，新一代的光機電模塊提供了一種成本效益高的方法，將一個可外部控制的次級光源集成到諸如蔡司（Zeiss）、尼康（Nikon）和奧林巴斯（Olymous）等領*xian制造商的傳統(tǒng)三目顯微鏡中。操作原理很簡單（見圖1）：將45°分束器放置在顯微鏡主體（管）的無限空間中。具體來說，二向色、帶通或其他分束器被固定在一個緊湊的滑塊組件中，該滑塊組件在顯微鏡主體和三目鏡頭之間機械地吻合。一旦將滑塊機制安裝在顯微鏡中，分光器就可以從顯微鏡的光學路徑中插入或撤出，甚至可以更換為另一個分光器，而無需任何機械干擾或拆卸。

圖1. 光學機械模塊，例如Siskiyou IS-OGP，提供了一種成本效益高的方法，用于將一個可外部控制的次級光源集成到傳統(tǒng)的三目顯微鏡中。一個45°的二向色鏡、帶通或其他分光器被固定在一個緊湊的滑塊組件中，該組件在顯微鏡主體和三目頭之間機械地嵌合?；瑝K允許分光器無縫插入和從顯微鏡光路中撤出，甚至可以更換為另一個分光器。

從單模光纖耦合的準直器輸入的準直光通過一個精密的XY雙撓性支架橫向輸入到組件中（見圖2）。顯微鏡物鏡將結果光點聚焦在樣本平面上。光點直徑取決于光的波長和物鏡的倍數；使用常規(guī)的20X物鏡，488nm的光通常被聚焦到大約5μm的極限光點直徑。在支架中調整準直器可以使得使用20倍物鏡時光點直徑從5μm變化到50μm。

圖2.IS-OGP是Siskiyou公司的一個模塊化子組件，它將來自輸入單模光纖的光束校準，并通過45°分光器將其引導至直立顯微鏡的視野中的任何位置。產生的光點具有可調直徑，并且可以通過機械（差動螺釘）或自動化執(zhí)行器精確定位或掃描。

緊湊型準直器配置有標準的FC-female輸入插座，因此可以接受通過單模光纖傳輸的任何光源。雙撓性jian*端/傾斜安裝裝置提供了簡單調整聚焦點位置的功能——與基于雙軸平移的替代方法相比，背隙得到最小化。焦平面的微調靈敏度再次取決于物鏡的功率，但與顯微鏡筒長無關。當使用20X物鏡與本裝置標準配備的微分螺釘時，粗調的每轉大約為110μm，細調的每轉為9μm。此外，柔性支架接受電機驅動器，適合那些希望實現自動控制的人。

使用由多個子模塊組成的光學顯微鏡模塊的另一個優(yōu)勢是成本效益的靈活性。例如，分束器滑塊模塊可以單獨使用，以創(chuàng)建固定的、45°雙向通向顯微鏡無限空間的訪問。這使得可以使用額外的目鏡、相機或其他成像設備；例如，帶有偏振或帶通濾光片的設備。

賓夕法尼亞大學Mahoney神經科學研究所的 Minghong Ma 教授和 Wenqin Luo 使用這種新的模塊化設置進行他們的一些研究。Ma和Luo的研究小組正在使用光遺傳刺激和貼片鉗感測相結合的方法，在離體組織中研究嗅覺系統(tǒng)和脊髓中不同細胞類型是如何通過突觸連接的。他們使用470nm激光刺激表達ChR2的神經元，并使用全細胞膜片鉗技術監(jiān)測其他“記錄"細胞中的相應活動。

這些研究是在配備IS-OGP光遺傳學定位器的Olympus正置顯微鏡（型號BX61）下進行的。Ma教授解釋說：“這臺多功能顯微鏡是近十年的老設備，對于多個研究項目來說是一個重要的共享資源。然而，對于光遺傳學的一個限制是它只有一個輔助光源輸入——一個配置用于熒光照明的后側端口。我們的工作需要將這個端口專門用于表層熒光目的。ISOGP提供了一種wan美的方法，可以在不干擾或損害顯微鏡的其他功能和能力的情況下，引入一個額外的激光用于光遺傳學。"

在Ma教授研究中的一個典型實驗里，一個300到500μm厚的組織切片被放置在記錄室中，并使用標準的含氧溶液保持其活力。熒光顯微鏡用于尋找表達ChR2的神經元軸突；然后使用差分干涉對比（DIC）成像來定位ChR2軸突旁的合適細胞。隨后，使用貼片鉗電極與該細胞接觸，以便觀察由于使用470納米激光光（通過IS-OGP模塊引入視野）選擇性刺激ChR2軸突而引起的膜電位變化。典型數據圖3所示。

圖3.嗅球（OB）神經元接收來自嗅覺感覺神經元的輸入，并表現出光激發(fā)的反應。

(a) 一個OB切片顯示了共表達氣味受體M72和ChR2的嗅覺感覺神經元的軸突（左），在另一切片下，熒光照明（右，上）和差分干涉對比（右，下）中，OB神經元是可見的。

(b) 在電壓鉗制配置下（Vhold = -70 mV）從OB神經元進行全細胞記錄：激光刺激引起大的、向內的突觸后電流，表明光敏感的嗅覺感覺神經元與這個細胞形成了突觸。

產品特點

l 顯微鏡安裝方便

l 簡單的光束控制

l 使用單模連接器光源

l 專為蔡司（Zeiss）、尼康（Nikon）和奧林巴斯（Olymous）顯微鏡設計